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本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。; }2 G1 F& y. h! v u" M1 J4 H7 \( A
- \* z' [2 B: I& e5 |自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：
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1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。
# H8 Q6 O" ?& \1 Z 备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF
M4 m8 A. g$ y% V2 x 疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？4 Y/ T. }+ C, V! P
2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。
, v8 n. d% C7 U" G: f 疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？
; ]( {5 ]( r' L5 c6 ~; W3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说 差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。
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; v8 F& \% a* L% m于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin4 R/ r3 W v6 P! X9 c0 X
1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解 变性。
. J o% f& w8 w9 y! g2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v 分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。
% `9 k" ~: L1 r: n) U1 |4 A! ?3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行 转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离 及 形状）
5 b6 m* l Q: W7 z) @$ a) n4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做: a6 Q+ }$ a8 |7 f
5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜. }+ Y, x5 s! g* v% s
6.一抗孵育 二抗孵育 暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ··· 失败！
; [4 O( G1 P1 z2 e& V' _: B: o. H& y7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题# M! m i" a6 o; l: @0 a! w
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实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低
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9 n% a2 n( o! ^2 H不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的
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发表于 2013-5-23 23:03
发表于 2013-5-24 10:30
