关于EB的形成与克隆的挑取

your1024

请教一下各位：
4 M0 i: g" q2 f) [1、如果用悬滴法形成EB的话，是使用纯的ES/iPS来进行的么？细胞量大概在多少呢？那MEF是如何消除干净的呢？
3 \: x% a1 x% V. U4 }9 l7 _8 ?2、如果直接用悬浮法的话，就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么？是单细胞悬液么？MEF不需要清除么？: e# z# q9 f/ A+ C5 ~3 i1 F
3、还有在细胞克隆形成的时候，如果需要把克隆挑取出来，各位是用的什么设备呢？普通的体式显微镜能够看到么？还是需要什么特殊的配件才可以？2 f0 u) J/ m* \# X
谢谢各位！

nichifanlema2

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悬滴法产量太少，也不太适合人的多能干细胞，基本都会死掉，自然也不会形成EB。Y是指的Y27632,。小细胞团块形成的EB会大小不一，但是不影响后续实验，形状是典型的EB形状。

echoxy1020

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# F3 Z* I; v' f/ |& G( Q' O/ F5 N; C
8 W, G: G, ~3 j" l  \% x非常感谢！我查了一下，悬滴法和悬浮法应该是不同的吧，哪种更适合人ips呢？如果采用悬浮，培养基还是用日常ips培养的液体吗？需不需要加什么特别的细胞因子？你说的加y.y是什么？我们用的是APEL，貌似不是专门的EB形成培养基。还有就是碎片大小不一，自然形成的WB大小是不是也会不一样，而且他们会太过松散吗？不好意思，问题太多，前面的人是成功的，但我做个两个多月了还没重复出来，所以在想试试别的方法，谢谢！

nichifanlema2

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" \) M  X, M- F1 J
+ {$ u. ]; s. W% E2 `1 QEDTA消化后的克隆非常小，甚至都会成为单细胞，这样细胞会非常容易死掉。另外，EB体外形成一般用悬浮培养，用96孔板稍麻烦一些，即使没有包被，也会贴壁，只是贴的很不牢，慢慢都死掉了。小克隆或者单细胞的悬液，悬浮培养做EB时，可以尝试加Y，或者商业化的EB形成培养基，价格没那么贵，效果会好很多。

echoxy1020

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您好，新手一枚，您说的这个方法是指把克隆吹打成小碎片，然后放在培养液里4-6天后即可自然形成EB吗？我最近在做用人ips细胞形成EB，方法是用EDTA消化掉滋养层细胞，然后收集ips细胞制成悬液，加到96孔板离心，原则上应该24小时后就可以形成EB了，但不知道为什么总是不成功，不知道您有无相关经验，请赐教，谢谢！

canyon

1- 贴壁第一天可以使用20%FBS，半量培养基，贴牢后再补加；
4 L, \9 S0 v* J/ z8 _, I2 P! ^2- EB球的数目，尽量多些吧，目测应该在100个以上才安全些。

your1024

回复 cn8867567 的帖子( ~5 K; F9 [! G* q! q- `$ _
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想再请教一下，EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么？我总是不能让EB很好的贴壁，要么是看着已经贴了，加液之后又重新悬浮起来；要么是放的时间长了，细胞都死了（本身带GFP的细胞，淬灭了），我用的孔板，事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢？还想问下，如果做WB或者PCR的话，6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢？谢谢！

your1024

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' y% o9 _% W" l6 T' r% A6 c8 A, Y  j- C
, @% y2 U( y" h$ [$ _想在请教一下，EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么？我总是不能让EB很好的贴壁，要么是看着已经贴了，加液之后又重新悬浮起来；要么是放的时间长了，细胞都死了（本身带GFP的细胞，淬灭了），我用的孔板，事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢？还想问下，如果做WB或者PCR的话，6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢？谢谢！

cn8867567

挑取克隆就是用体视显微镜，但是你的显微镜是在相应超净台中的吗？如果不是，你就需要注意防止污染的问题了！

cn8867567

1.去除MEF细胞，你可以把消化的细胞，先置于细胞培养皿中37℃培养半个小时，残余MEF应该都贴壁了，将细胞悬液吸出，用这个悬液形成EB。
. O) Z6 c8 K6 X/ K' J" V4 i% j2.如果是小鼠的ES/iPS,消化后是单个细胞，悬液制成（1-1.5）*10^5/ml，20μl形成一个悬滴。悬滴培养2天后，转移到petri dish中悬浮培养。