关于EB的形成与克隆的挑取

your1024

请教一下各位：
5 S- T7 R) U3 @1、如果用悬滴法形成EB的话，是使用纯的ES/iPS来进行的么？细胞量大概在多少呢？那MEF是如何消除干净的呢？
' y/ m- D6 Q2 w6 T# ~: o2、如果直接用悬浮法的话，就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么？是单细胞悬液么？MEF不需要清除么？
6 J9 O# A- q3 L3、还有在细胞克隆形成的时候，如果需要把克隆挑取出来，各位是用的什么设备呢？普通的体式显微镜能够看到么？还是需要什么特殊的配件才可以？
. _$ K7 H5 \% v* D谢谢各位！

canyon

这是小鼠的还是人的iPSCs？人iPSCs用悬滴法不太适合。

nichifanlema2

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3 X( v7 o! ]' X' Q! Q! O" |# h. d+ l, I9 s. _  M' C; |
要是人的ES或者iPS的话，消化后吹打成比传代克隆稍大的克隆，收集到离心管，静置一段时间除去上清后，加无bFGF的培养基重悬，转移到国产的细胞培养皿悬浮培养4-6天即可。

cn8867567

1.去除MEF细胞，你可以把消化的细胞，先置于细胞培养皿中37℃培养半个小时，残余MEF应该都贴壁了，将细胞悬液吸出，用这个悬液形成EB。
% L3 m! a1 Q5 _/ `2.如果是小鼠的ES/iPS,消化后是单个细胞，悬液制成（1-1.5）*10^5/ml，20μl形成一个悬滴。悬滴培养2天后，转移到petri dish中悬浮培养。

cn8867567

挑取克隆就是用体视显微镜，但是你的显微镜是在相应超净台中的吗？如果不是，你就需要注意防止污染的问题了！

your1024

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1 b' H( S5 T! m: ~6 K' i$ y6 n" p( S$ E  A& C
想在请教一下，EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么？我总是不能让EB很好的贴壁，要么是看着已经贴了，加液之后又重新悬浮起来；要么是放的时间长了，细胞都死了（本身带GFP的细胞，淬灭了），我用的孔板，事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢？还想问下，如果做WB或者PCR的话，6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢？谢谢！

your1024

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$ S2 D. J: a* G" [( s# `9 A+ L想再请教一下，EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么？我总是不能让EB很好的贴壁，要么是看着已经贴了，加液之后又重新悬浮起来；要么是放的时间长了，细胞都死了（本身带GFP的细胞，淬灭了），我用的孔板，事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢？还想问下，如果做WB或者PCR的话，6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢？谢谢！

canyon

1- 贴壁第一天可以使用20%FBS，半量培养基，贴牢后再补加；
7 I) V  v" n7 Q& n+ y$ w$ m2- EB球的数目，尽量多些吧，目测应该在100个以上才安全些。

echoxy1020

回复 nichifanlema2 的帖子1 q0 M0 U/ Q# a1 O6 F
2 y" \) k# V' g/ o- c! B9 a
您好，新手一枚，您说的这个方法是指把克隆吹打成小碎片，然后放在培养液里4-6天后即可自然形成EB吗？我最近在做用人ips细胞形成EB，方法是用EDTA消化掉滋养层细胞，然后收集ips细胞制成悬液，加到96孔板离心，原则上应该24小时后就可以形成EB了，但不知道为什么总是不成功，不知道您有无相关经验，请赐教，谢谢！

nichifanlema2

回复 echoxy1020 的帖子5 |! H& S* U# H! ]; x" l/ C
3 R* q7 g2 t: B% w- Q! n) q, k4 t
EDTA消化后的克隆非常小，甚至都会成为单细胞，这样细胞会非常容易死掉。另外，EB体外形成一般用悬浮培养，用96孔板稍麻烦一些，即使没有包被，也会贴壁，只是贴的很不牢，慢慢都死掉了。小克隆或者单细胞的悬液，悬浮培养做EB时，可以尝试加Y，或者商业化的EB形成培养基，价格没那么贵，效果会好很多。