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关于EB的形成与克隆的挑取 [复制链接]

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楼主
发表于 2013-6-5 16:15 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
请教一下各位:
- C& f5 ~& p& p* U/ v3 I2 u9 B1、如果用悬滴法形成EB的话,是使用纯的ES/iPS来进行的么?细胞量大概在多少呢?那MEF是如何消除干净的呢?
7 x' K. e. x. @9 O  ^2、如果直接用悬浮法的话,就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么?是单细胞悬液么?MEF不需要清除么?
+ t8 k" Y" q8 j/ h7 U! F3 }3、还有在细胞克隆形成的时候,如果需要把克隆挑取出来,各位是用的什么设备呢?普通的体式显微镜能够看到么?还是需要什么特殊的配件才可以?+ |+ p0 t* i: h' B; a; Q
谢谢各位!

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沙发
发表于 2013-6-19 10:43 |只看该作者
这是小鼠的还是人的iPSCs?人iPSCs用悬滴法不太适合。
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藤椅
发表于 2013-6-20 17:26 |只看该作者
回复 your1024 的帖子
8 p3 w( k/ m3 K: S
; ~4 H/ w2 k3 Z- M要是人的ES或者iPS的话,消化后吹打成比传代克隆稍大的克隆,收集到离心管,静置一段时间除去上清后,加无bFGF的培养基重悬,转移到国产的细胞培养皿悬浮培养4-6天即可。
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板凳
发表于 2013-7-12 11:01 |只看该作者
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1.去除MEF细胞,你可以把消化的细胞,先置于细胞培养皿中37℃培养半个小时,残余MEF应该都贴壁了,将细胞悬液吸出,用这个悬液形成EB。
( \  u. y. C9 Z- K2.如果是小鼠的ES/iPS,消化后是单个细胞,悬液制成(1-1.5)*10^5/ml,20μl形成一个悬滴。悬滴培养2天后,转移到petri dish中悬浮培养。
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报纸
发表于 2013-7-12 11:03 |只看该作者
挑取克隆就是用体视显微镜,但是你的显微镜是在相应超净台中的吗?如果不是,你就需要注意防止污染的问题了!
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地板
发表于 2013-7-18 19:57 |只看该作者
回复 nichifanlema2 的帖子
1 o( ~% T5 E' ~' {) f% v4 k' @7 ?& @7 V  e! q0 C
想在请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!

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发表于 2013-7-18 19:57 |只看该作者
回复 cn8867567 的帖子
1 B5 \$ t$ p+ t; n: X+ w; \
1 e/ u( ]" v; F& t0 `0 d( Z想再请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!

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发表于 2013-8-11 01:39 |只看该作者
1- 贴壁第一天可以使用20%FBS,半量培养基,贴牢后再补加;
5 T9 p$ L6 f3 ], v; v2- EB球的数目,尽量多些吧,目测应该在100个以上才安全些。
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发表于 2016-8-9 04:38 |只看该作者
回复 nichifanlema2 的帖子
1 j- B3 X/ O8 F9 ~  S* j/ L; q" s- T
# J1 ^9 y, i7 Y您好,新手一枚,您说的这个方法是指把克隆吹打成小碎片,然后放在培养液里4-6天后即可自然形成EB吗?我最近在做用人ips细胞形成EB,方法是用EDTA消化掉滋养层细胞,然后收集ips细胞制成悬液,加到96孔板离心,原则上应该24小时后就可以形成EB了,但不知道为什么总是不成功,不知道您有无相关经验,请赐教,谢谢!
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发表于 2016-8-9 08:41 |只看该作者
回复 echoxy1020 的帖子. u% l1 G' M  s2 x- |

9 w% N( t* U5 J6 n) wEDTA消化后的克隆非常小,甚至都会成为单细胞,这样细胞会非常容易死掉。另外,EB体外形成一般用悬浮培养,用96孔板稍麻烦一些,即使没有包被,也会贴壁,只是贴的很不牢,慢慢都死掉了。小克隆或者单细胞的悬液,悬浮培养做EB时,可以尝试加Y,或者商业化的EB形成培养基,价格没那么贵,效果会好很多。
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