如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议
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自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内
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$ P! A! Y; c/ {6 }+ c3 Q0 n; D问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。4 t% l; a& q, s7 `

" g2 u5 h: t7 N拟解决方法：  
2 w# c* v# m, x# q5 e方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。
, s6 v/ q% G- Q5 K4 P4 u: m方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   1 J  M$ q, o8 m  m% N- s
               写着 发现有点牵强···）* q% L2 H$ v4 Z5 @9 X
方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···. @) r: p. {5 A5 h3 J& p2 J/ r$ e; D
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4 H  D+ i# P8 q" ]) l! e+ I" D$ |* C恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

小兔子lp

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

daiying5200000

建议用荧光共振能量转移。

寒山拾得

IF & 提核蛋白WB

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；8 B) _0 ]) s& B/ s5 ~7 _$ ]7 ^# x. I
2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；; K; w% {+ Y( y# w! U; i
3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；
" r. F: H/ v+ C4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；6 A* P0 C, n7 O: q$ V! w
5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。6 U! r& ?7 |7 O1 V* o0 }
6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。1 g" C# I2 z+ w+ r! H& |
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。
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5 q, O- C( N. A  u（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）- r, A* K$ L' k; d5 K

Andyhigh

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9 g7 ]* {) g2 {9 u/ D  D
# X7 |$ F/ ~- l. W- I4 C+ @首先谢谢你们的意见和建议；
3 n8 f$ |1 l+ h' z! B, g: i3 K
9 J3 }0 ?  W& k/ u9 L. I自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；
" W; `$ ?, \7 g0 ~9 `构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。# Q& C. e* {, Q
蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；
9 E6 f  [  B) ~+ k% \6 b
8 K: X) [2 X# \- R还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！8 q5 z! Q& B7 s: l
对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  
$ w- `! D/ z; u' B& ~8 F9 d; |% {) L- w% f1 \* _
各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

3 p' p/ {" ]8 P! l  B
" [7 ]$ L- g# g; x, z
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& l5 {! }4 Q2 m6 G  o% X) P  }" r( d) @8 S4 y
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

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+ R1 w% R7 S0 u  Q* J; ^% q, ]( x; Y% b; H; U' o- }9 I
问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。# c- ^( C; }+ P/ S6 X* X7 q% q

' K1 r' K7 |" F3 u: _( ]2 s因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？6 q- U, i  v) K

' p) m! ?7 C- @: ?7 G. b2 c如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子0 H: P8 t9 F# e* E* L

) Z6 ?' f$ I8 ?/ K" m一个完全陌生的专业词汇···