如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议
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; q' L2 r* z+ [' E自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内/ J$ e2 M; Z5 @( n7 @8 E

( i$ J- v3 S" j% X" \问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。$ s) \5 f# f3 [& T# _- N, q

  N# A& r3 k4 S& M+ e+ F9 P拟解决方法：  5 c: o8 C! ~3 A, {7 ~
方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。6 E; F/ {3 ~, L$ m8 ~
方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   
& P! [  M7 W& o8 F) b+ K0 B               写着 发现有点牵强···）
  A& y: z% Q2 k2 ~" d. A5 Q方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···# G+ _) K5 `; r

" U) p2 `4 A0 f* e! R/ ]1 x
0 G% O& N- e" ]3 K, {2 p
$ t8 U  ?7 D3 |( w! G& M恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

小兔子lp

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

daiying5200000

建议用荧光共振能量转移。

寒山拾得

IF & 提核蛋白WB

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；
) |+ W: C* X' F% O4 \2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；3 R$ G5 H  R; E$ g9 U5 G7 J
3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；
: ~* T4 g* [/ V* b+ `: F' F4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；
2 _2 j( K; N7 X! R5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
2 p% u6 }9 J8 q( G4 ]6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。/ b( r2 W3 `0 x: d+ S$ _4 s
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。
  z* X1 ^, E) E+ ~' B
4 n/ x- E+ H) Z+ j9 X3 k（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）
8 k$ X9 i' M0 y; b

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子3 Z1 u. v- r" A- U7 P* g

- m. i* Z+ S, k9 l$ F. ]首先谢谢你们的意见和建议；
* p. L) S3 W7 i/ _7 e$ g, ?
/ u! H# F. N/ v3 ?自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；
; }% {, r  f+ g" @0 e- [构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。
8 j8 ^, d6 Q% B! L$ X( z1 x+ F蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；
# \* v+ Z6 A. _5 Z$ f1 O0 O; K: I+ j8 Y' G
还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！
/ h! c: u' V/ s1 ?3 `对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  3 U1 H3 w9 k% w* ~. q

) i) p+ H0 |$ \各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

* e  |1 r! n+ p. V9 y4 t7 s& v( N) f0 X' Z
回复 小兔子lp 的帖子# E1 X# s+ w! ^$ x
# W8 q0 }4 j3 O% i  w) \
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

回复 寒山拾得 的帖子  {* U0 n' Z8 A* S( {( Y. i- }

7 o- Y* P$ n4 u& g9 ^问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。
5 d# q2 ?4 C4 g$ ]# K% W2 Y
( Y4 f3 B0 s: I) j: J因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？
" {; a/ L; C( E! }. ?" v# y
6 H& g& U& E, L. a% }9 K" \4 h如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
& X3 R2 C( N2 n# e; l& R- ^8 p
  ^8 M+ n" A: M5 ?& ^一个完全陌生的专业词汇···