如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议( S+ z; z" `8 f6 e
# w. Q$ A* p, w* ]5 p: R  h
自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内
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1 V  s- o' N6 @) x/ m% {! q( e问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。
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拟解决方法：  9 I5 {, O" W+ c' v1 u+ I
方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。
& M4 K1 M  I& x方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   
+ S6 l3 I$ M  e/ E4 S# ?               写着 发现有点牵强···）$ A! s$ ?: A/ i0 @! k
方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···# B6 _$ w/ \2 Y* v% n" e

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* g, H$ R: i! N$ m+ g; x; j
. f4 r* \. [* e8 l恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

小兔子lp

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

daiying5200000

建议用荧光共振能量转移。

寒山拾得

IF & 提核蛋白WB

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；
  Q/ `+ h  U. t& Y3 j" U  T# g2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；
" ~4 Q+ e+ ?9 I0 u% o) J3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；* D9 v( }2 W0 v: X9 o" ?0 u
4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；
0 A" j5 I% Q2 ^" B; Y$ g5 U5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
: j* D8 v- i$ ^1 w6 n* W: C8 i6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。+ f* C5 w9 h) ?, X6 d0 L, N+ g" _" U
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。$ ~/ o- q" u3 }: ~

5 Y! k: v/ C/ p/ A% _（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）
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Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子- d7 N: [/ ~% F

( p6 K- i5 y; q8 C3 z* B7 e首先谢谢你们的意见和建议；6 V6 J: b  d6 a- Q, R

: r. s7 e: R: b) j/ H5 k. L自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；1 N" [3 `1 G5 ]  \* M
构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。7 Z' K! e: \& u
蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；
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7 [# w! g4 j3 v7 [7 `: U1 [% c+ X还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！
+ n4 g7 n. |: r. T* H4 E' {  x* ]对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  - g$ j. B- }2 q" x/ u

/ L0 E( z- h& w2 }3 L7 }, @, k各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

) M9 u* p9 E  J" {- R, H
6 U5 d, L; ?, F$ C9 ~) x; B% D: T( D回复 小兔子lp 的帖子/ \$ H( Q) ~$ Q) c
, v! Z- [! T% w' |9 n& [
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

回复 寒山拾得 的帖子& U/ s/ a5 ?" I' ~8 F5 s+ C

) z' X) E- I  ]问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。
" q$ }' o) o# |8 _
, z% r1 B# X6 f$ F因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？! Y# `" s9 \, W3 z; ~

7 ~' Y) |! h6 h1 F5 `& y7 J! Y2 g如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

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1 l* W/ O' M7 L3 `一个完全陌生的专业词汇···