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自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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* W- q g2 }3 m; f% A+ p/ @$ V题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors 杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ ) m& E: s) `7 L. [% C; `9 E
8 n0 C, K5 ~5 F一. 文章的结构：
, w% k. B7 Y" h& \* y7 z1 j1. 蛋白的制备分为A、B两组：* e9 v7 L/ G) |1 G& V$ A1 }5 V5 o
A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白； 可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。: j" A7 `# l V6 z
B组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。
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2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
- G3 F' z% g9 T6 d r8 h考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。
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3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比. b4 a! r' \+ ~! m5 M# `
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二. 总结8 o" t( m$ I3 Y! S! c6 v
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路& L& T( i& k. U8 s( K
2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
m, z4 r* d7 f# K: ~3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的; B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。; o( w. I3 i3 ]6 V
3 \+ E7 Z8 l9 u2 `1 o: \三. 疑问
: ?+ R8 V* L" c+ s' @( N4 R* E. U1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点
/ X Y$ R0 S/ K0 K9 Y3 ]2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
. J0 r6 o4 Z3 J1 i3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系 对于这一问题大家怎么看？？？3 d4 m& u& t3 G9 o- v3 o
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！ 这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。
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, d% h6 m4 ?$ O: J欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！8 }! I8 V# C* |! n
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3 P& D/ y. w$ f4 v# }补充内容 (2014-3-29 22:10):! T" B9 i) F: x) F/ u* y
关于蛋白质介导体细胞重编程:* L O- p+ Q1 R2 R8 i- Q3 y0 K
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；7 r& Z3 ~1 p: p: D# A3 ^
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！
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/ w' _1 n+ X$ t5 ~) N补充内容 (2014-3-29 22:16):" v% T7 o/ P$ ~6 _$ x& W t
3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？; a ] m0 F! j5 r- r
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补充内容 (2014-4-6 14:55):: ]% t( c4 y' P Q( r& ]
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！ |
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发表于 2014-3-28 20:37
