2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！7 J7 V5 W& y  J5 q% s3 x* i9 f$ L
# h$ d' G  E# s
题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ " B" P% X) j1 O) A2 X2 n+ V  z

* D. P+ p9 e# a! I- _. t6 z一. 文章的结构：
  V9 [. n/ a4 N$ z+ s& y1. 蛋白的制备分为A、B两组：
" n! v: \7 l0 q4 yA组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
* |% y; _. r9 h! f* \* UB组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。
* R3 W+ S) F4 [- D' E, ?
  h. x: q* l/ \, T, z; h2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
! i6 B* j+ \; d, \8 @+ k9 }/ U考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。) ~1 x# H* c5 f, }  U& F
' W7 W4 O2 s) V8 f7 [! v
3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比
0 x) |7 [- k" N# E6 l; ~/ n8 K- q: m: m$ S/ ^5 P' K4 g
二. 总结
! m! E5 B5 @9 P1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
; s5 R- y6 n. ]* E" n2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
2 I, ?' G; M, I) \$ ]4 m1 q2 A. @7 v3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。
5 ~1 P" f; L9 o" z' V( M) ~9 M$ |/ u0 f6 a. z8 d- u0 e
三. 疑问
) l1 G8 F& J3 y. g( M1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点/ R- {$ h* B$ S' b/ Z1 U; I+ N- l# w
2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
8 M& f+ p0 b: y( M3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？
# N+ f+ h' F5 O0 z/ m6 p; Z4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   3 ?; u4 v0 N' P' m

/ K& J0 A& u3 q, i欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！
4 S$ o. B) d* z7 k5 ?. d- h0 j1 S. z. K# ]( p4 N2 M$ G, l
8 y) Q, d. ]) O) G
补充内容 (2014-3-29 22:10):
; I+ x! f. ^7 H' R: t- m关于蛋白质介导体细胞重编程:6 \" {5 Q/ W" d6 E% e( y, I& O
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；. Q7 ~1 W  ~& c/ U9 ]6 x( W+ f
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！
+ i0 ?% r! f9 R# J* I4 G4 ?- k, [$ }2 j6 W  d% D/ X- i: ?  G+ F
补充内容 (2014-3-29 22:16):
" m2 A  a& Q( @. x8 q7 {# P3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？
: J- t) F( Q. \" H. C7 z  _! Q9 D2 {$ k/ ]# s0 g

% |; o; [/ Y6 S) {补充内容 (2014-4-6 14:55):
$ a, J2 j0 i) |感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

Andyhigh

Damon-Salvatore

我有一个老师10年发了篇用TAT引导OSMK进入细胞进行重编程的文章，但是由于重组蛋白进入细胞后，滞留在内含体内，效果并不是太好。原文如下：; G5 H- P0 p/ a4 o) \# V
# r8 B! ~# n, D4 [
9 I) M7 M& n/ q/ `
补充内容 (2014-3-29 08:45):6 p2 h- w8 d  w" ^! ^( t6 x
剩余的希望大家多多指点

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子. n0 R& Y; `  K: x6 B$ W
0 [1 t* T' m2 M- P3 H
这篇文章看过了，你现在还在西北农林嘛？

Damon-Salvatore

回复 Andyhigh 的帖子
9 Q1 S1 l+ _7 @" K$ @" H, _! J8 x" U3 F- M+ m  K  m3 A
嗯 现在大三。前辈现在在什么单位呢？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子
' H) g( d1 S7 i) s
: [" I$ ^5 r* Q( k, ^% `6 t在安农大读研究生，你也算是个牛人啊，我大三都不知道在干啥呢！

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子
0 N7 U7 [% a( M7 }7 p' @/ Y
/ q1 x( A% B4 e7 E& v第34届国际动物遗传学大会今年七月底在 西安 举办，  这个会议你可以关注下
' i0 G( ?' W% I( ]5 i) }% Y+ l' B链接：http://www.isag2014.com/plus/list.php?tid=29

Damon-Salvatore

回复 Andyhigh 的帖子
4 n1 B* ]( r* i: c+ o1 H& }  B% a6 M" J* k
恩 谢谢前辈。这种会议是在什么地方找到的呢？亏我还在西安附近，这些都不知道。是在科学网还是？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子
! k$ S& Y+ ?( {* `5 e7 i. w# d! r- h  k; v+ f& Y0 S% f
是去年在成都开会，李宁院士在会上 把这个会做了一个广告，之后就一直留意了下，07年诺比尔奖得主 Mario Capecchi 教授也出席这个会议；这些东西是朋友多了，圈子大了，也就知道了！

Andyhigh

关于EMT-MET的文章：