PBMC没有分离出来

momoenn

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6 x4 d# g% m( C+ Z* m: S今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39
! x8 l2 \3 t# w& t( V2 S今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

& a9 _5 b7 H" t' N1 `能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！
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! Z' U- X$ R0 X0 G! a/ e; n首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：( E7 |, a5 b. c( f. Z5 d
+ Y- C4 d" G1 K# Z9 V
一、        溶液配制
. i0 Y- ^! \: b; [. D* ?1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。
+ o0 x* [( w# _. H. P: N; C; V2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释
* Y, K/ z4 {; E( C5 E8 Z, P3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液' L9 S5 b1 N8 K2 u* F2 p
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。
1 M) v" a+ M4 s5 w- |6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。8 @+ q; g  I8 o
7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
$ C9 |9 X# @$ Q9 t8、        6~8周龄雌鼠
& W7 J, @' B/ b9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
6 d1 R6 d, d8 R' n' t* z3 w10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA) ]" K" {5 w* C! y5 a" N
二 . 小鼠淋巴细胞的获取：0 b. t; o8 x7 O; I, T
1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。8 R# R( `) |$ C
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。/ L5 e: Q( a, ?  S1 J& ^
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。
( y- a5 a) O& e; ~4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。
0 I* \; o; }! Y% o. Z% t8 V$ H5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。: [0 F$ S. {7 R" }+ v' L. Y
6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。' P, |8 ?- R1 V: n' ~. h5 n; l1 L, G
7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。4 C. z" x1 a. B- t4 B
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。/ z) N( v$ \& P) I
9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。
' Q$ j* |; Z2 l8 h1 R3 t4 v10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。/ _- M' x2 |1 ?5 V0 C
11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。
9 K% z  P/ z  {* s# I12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。/ D: D& m" ?2 v0 U% D
13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。
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% U3 Y) R) b2 w

thor0504

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) b  a+ Y) I1 z; {, m
: ^2 N  [4 K; C* |8 y9 J0 R取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

回复 Andyhigh 的帖子9 a4 R7 t' _9 c( m& E$ Y- Q

, r; D2 ~8 R0 H/ {) g+ w  H  j; M我们用的是ficoll

momoenn

回复 thor0504 的帖子/ R- b1 t# o  w+ P- l! \
. X2 C) \$ N' N. |% l, {% x- q* F7 k
100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

回复 momoenn 的帖子, }. W$ R. w. W% k, o

/ ~& j: `* w1 z, F$ n, r; E具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了
  @3 G" }, J5 R  v- r

weijunning

回复 momoenn 的帖子* q% K7 X+ G( B% H& H: n, K$ w
/ f4 e0 ]' r3 j/ n' f
请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。