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0 P# G! s& Y, a6 Q7 | X* Q
我的操作步骤：
" A5 X1 F: C2 {1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】
/ V- H5 z* D3 u- c2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；
# T1 f- p9 ~: N3 A" I3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；& r, U( H; A( S5 D
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
' n2 S$ k3 l0 F9 ~- i, j5.“NEST” T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
+ I5 C& x- ~ s. J7 v6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
: Z+ ]- G: ]5 `" |; m2 I+ b7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；
' e) E, J: V+ z8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
8 K; R- `% N* C Z2 M9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco; PBS---Solarbio粉末自己配的。( b: E& h- u* k; \8 Z3 {3 _
: k" T) ?! z, t6 w2 U: O我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
6 f* d6 P! v8 r# }. _% y附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍- G* p' o, C/ i* j
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发表于 2014-7-21 14:58
