MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。9 t3 A% f( f* V/ W" @

; o7 L$ F1 K8 A( L2 e1 r免疫细胞荧光化学技术的步骤:
1 m9 P' I+ x: `4 x. Q8 W( c; j! g# S  b4 Z, S. Z
   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。* L' D% f3 O6 q; d9 W
% P+ d/ i' |" `+ M
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。5 U' e! e% J; H$ z& _8 \: Y
PBS洗3次 ，5min/次.6 g" Q6 L' T; U5 v
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS/ r) G( i: ?2 t/ h9 i  C
洗3次，5min/次.
' u! z; m6 v" _- E& v4 y2 ~8 S3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。& d& e: i  k$ N* b1 r' ~% W
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.6 E  D: v) P2 s; g5 |9 B
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
/ L! s/ I3 M- O5min/次.
: l9 |0 H4 ?% K1 P' E+ f3 M8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。( M6 t$ ~3 ?: V8 B3 h8 ?! o
! L2 n- y4 n; u+ B% x+ O4 W" \
这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：, r; ^0 D, w5 m7 c; H4 u
固定，3.5%PFA，30min# V( w8 Y: t: J& G% m  d
透膜，15min RT/ @$ ^' `* {, E# J* K# y
封闭，1%BSA 1h RT dark
/ t) K& u+ v2 T加抗体之前我都洗了的5 y9 H3 O6 r8 z+ ]4 Z
过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
0 G1 D! k! U# [! l0 J最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng
5 [" Y/ b( Y9 A4 Q3 R' A& j6 d9 t9 }& ~, g: U' B# H
关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：
" d- y# E9 T; W5 r8 J1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？' W1 b) I% a% E/ j3 g' ]
2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？3 t/ @3 c# r- E! O/ _& A( ?
3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？3 G8 F6 f; Y- W4 b! j
4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey 3 y+ }3 T4 Z4 L+ M; ?' c5 P
. z. D) y& i( M+ d0 a3 J

. @0 v- w/ c, o  \/ u' Q    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？
) @' d1 o) Q: e0 ]& u: L- @8 I& T$ ]  O- z* e
我一直被告知不能看.....汗