u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。
6 Z9 p8 ~  a% N/ h2 x4 n有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

$ e: m6 w4 m7 R3 a: n; h
7 P) L- _2 l5 S# _4 Y0 K
你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：
# q% n# I2 A8 S7 ?; k/ }$ c1 ~5 Z+ w/ T+ O5 K
SURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III 1 I- p( l, |- v8 ]
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283
- P. \- u. p" {3 T; W4 c+ Y1 y% e- i1 U3 f+ I

% I0 E% G* ~9 {  j( C# y9 c希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：- L+ ?5 Z, L$ A, K8 ^- Y- G
第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。! x+ x2 `# o  R+ [& d. D
第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。( t# L  j, \9 E
这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
: B6 p: t! f1 n: t# l! Z8 c* I" k等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。; [$ `( F# |3 E# c4 e+ n7 j
所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。/ f2 l$ r; g$ ~. t6 C
至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子
" |8 s3 X/ O$ M1 g' D
  \5 I* n+ D+ k! X3 B% N4 y  S1 Y. t我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
. p" \! A9 y" p& o( T! j  X* W4 O- g& u, S1 m2 t" C7 Y
同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。
! U: n: x% N  W2 k
7 z3 t4 w0 u( ~$ w  ~4 h官方Protocol也证实这一点：3 t. c" A& r* e3 v+ d# `

  R( Z+ U% o' m, Y- ihttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
- Z8 b5 e( W$ l2 Z$ x

hughliang

4 M* T8 R8 Y: g# C8 }% S1 A' r( h
8 [* g3 j& ^! A3 t. Y" x+ ^
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
, z" {2 m5 n1 u, c4 i/ d- e' a8 p% j, b! W$ `$ a- J- y0 x
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
) E- z8 x( w+ e) }4 U! ]5 Q* p7 a8 Y+ W3 s. ]
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。! F" \* `. ~" C) k/ R6 j. K3 p- _3 s

2 N: U3 ]% u9 c& m向大家请教原因和克服的办法，先谢！
3 u* H& d$ g8 S2 x1 A3 t8 v

fguw

回复 hughliang 的帖子) F0 c1 Q1 o, \0 j
" I+ q1 a5 y" D4 b7 y! m# B5 E7 J; K
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，5 ^2 K3 S$ b3 M+ f
没有实验结果验证，猜的9 O" Y% S3 G6 ?3 @, v/ Y$ t
作普通转基因有类似问题，
' Y) o" N7 \1 H3 Z/ P% V/ |有问题，欢迎探讨

runsong

4 n; q5 ~& |2 m
3 G- e5 o# O$ @5 o6 M0 @
回复 hughliang 的帖子
8 L/ `5 I( B* C1 z6 ]  C' V: B
. _3 L3 f1 W( R- ~, o) a十分感谢，你提供的线索太有价值了。
. L6 `2 I9 k/ P2 x即pll3.7中- J  B) `+ N5 J8 v; i! E
An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.# S6 \5 H# G6 h& {' s& c
引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
5 z/ R1 r( w: Z5 x# u) p) ~而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。
* R4 R6 m6 v8 g1 @《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）