关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。
" d# K4 j( Q. r' Y! j
& @3 o' o# ~/ I  j我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：
1 J/ M) S* ~9 x* ~) i& @6 }' O( {4 `9 B! T8 A
1. 全基因组DNA提取
' _# ^& }& B: w* N2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端
. V. v( G: B3 v8 B) E5 N3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接
8 k4 }5 f7 B2 g2 G8 i0 C4. 1st-Round PCR+ I) M8 q- m( {1 ]3 f
5. 2nd-Round PCR
3 @; o9 j, H2 N9 O, T2 p6. Sequencing* _' s9 t8 }& @) Y8 h, H7 A# q
* g+ T0 |% g0 y2 H! i( V
现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
0 V" s+ `) N6 v$ i因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
1 A7 C) f0 i2 g1 t! U. o
, T6 O2 i4 J% P* e  t; K5 b, t3 g比较着急，希望高人指点。谢谢~
0 _4 S) d3 O& e) h9 u4 ^. Q( _) Q% Z
附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

splinkerette

LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

splinkerette

附上文章

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子! I* f9 r1 _9 |
  o/ Q& S' N+ c6 y  V3 X; R4 f
谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

splinkerette

呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

钻石星辰

1 B" ]5 O( K6 f2 q+ g' K- g; L' v4 @8 U$ |$ J. U
回复 splinkerette 的帖子
9 a* W( _. S1 T4 I2 n
) O) o, F1 H- S# S- C/ m你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。
& M) W, c/ q+ `: B: O! F, c5 U: q8 H' J$ r  W5 I9 Q/ n
不过，我还有两个小问题：: s) O" H* [! ^; H% e
% |' d$ A# M# G! F" V0 N
1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。( B0 [$ Z: I- V- J& }0 B
这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？9 Y1 \( w9 r' \+ j5 Q

+ S2 S# Q( c. P（没有用过NEB的酶不好意思）/ \) I3 G7 ~" k
4 P/ \3 H) f: k, ?' K1 k% z
2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？: Y- ]0 ~+ P  z$ v- V; D2 D
6 Q: _; e" l! W7 F4 ?( |5 h

splinkerette

回复 钻石星辰 的帖子2 X. W: V& M# R4 l$ j9 N
; K" z1 g7 u% X+ D$ c  r
你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。
, h0 |* I6 y, ~# n0 ~( O( S7 g; r* A: h) S
两个问题：
8 P  d8 ?8 f: g; R( K: w1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，
6 {* I6 b: [. ?8 o( }: n至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。
+ p$ n8 U5 ?' k6 J2 g% I* z% x
5 @5 r* K. y1 W* r0 X2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶* U9 h5 l1 v0 C
附上一个图吧：
8 M' s1 s6 \9 S

splinkerette

回复 钻石星辰 的帖子2 ]0 G( x* p3 s2 B- n9 Y

! C" |! j/ ^% c/ {) {# MP.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子5 T4 y/ l% f( `: o
2 K# \% E0 \8 \6 h& c& K
谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

jiabiaohu

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+ s* k; X) ^2 O- _6 L: M' [5 b4 ]) }2 L
测序单上一般有PCR引物测序的，一般有两个选项，PCR纯化产物（即你跑电泳后割胶得到的），另外还有一个PCR未纯化，这个你也可以直接送过去，当你注明之后，测序公司会给你纯化的，当然测序费用可能要高些~~~