关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。% Z  @* V. G. z% m
  v- ?4 l$ l4 f# A% L
我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：
+ b" a* f8 I/ v+ S$ y* T# Y3 v! G! m5 u; Q% U
1. 全基因组DNA提取& d: c. @1 H7 K9 ~& O
2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端
- {' t' G0 K3 b9 p- r3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接
2 Y4 s! v5 Z5 b1 }4. 1st-Round PCR, D7 B( Y. |# R3 c
5. 2nd-Round PCR# \. Y6 K9 s& t* \
6. Sequencing2 H7 j3 _4 T  P+ A9 j* T$ m# v' F
4 e- ?' p' Q) M( u4 b  @
现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
! f8 b) _# i, j因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
/ \& L% v4 ^. H; N6 }6 b; J3 Z: M1 `8 ]* ^
比较着急，希望高人指点。谢谢~
  r! c* l# ^) W& s+ s5 W9 M9 @4 t: u2 w/ k# Q
附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

splinkerette

LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

splinkerette

附上文章

钻石星辰

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/ s' \& a0 X  Q. A" X, w$ |) K* T4 b
谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

splinkerette

呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

钻石星辰

& N% r3 x& Q* |' e5 C9 W3 F
$ U+ _6 f/ G. U
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6 V+ i% u. H- e, T' @/ C7 {% |0 {7 |9 I: Q: D! D9 o
你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。$ M( Y: w9 D: M& O- ^, y
" A) D& X3 {& A# \3 _
不过，我还有两个小问题：1 C: o7 N8 `1 q9 |
0 ^7 f. i4 z' o; P+ g& b
1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。0 D) t; ]  `3 [1 s9 @* j+ m: K
这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？
9 f7 M' g' K+ w6 E( g; g! d2 d
% r2 S) X1 p  Y: O2 C* E（没有用过NEB的酶不好意思）
( K  u! i4 |" h8 k9 M+ P% T% R, g. k: P" _
2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？
. F0 x3 ~4 K/ J, R; l" y
' f7 ?3 _% p$ Q7 P5 Y

splinkerette

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& e& N$ W9 A! C7 w( D
6 H6 Q+ ?7 b" S/ y8 v; d& P你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。% H: L) x( `1 I2 _3 e, u- i: }) H

" K( A1 \6 h9 @3 f" Q" @两个问题：, _+ n" b/ Y- ?; ^7 S$ M% o
1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，9 V0 i, K! j5 Y
至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。+ f  g: h; C: _* J
. I0 E( x6 N: E, G; t5 B
2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶
' @9 o/ j  H$ ^附上一个图吧：
  {. I2 ]( c: P+ O3 i/ A2 c

splinkerette

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; {6 G* ?& ]* z; h) r$ I
5 Z  _9 F) R* F. c& e5 B' q" cP.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

钻石星辰

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1 h- W0 l; [- b4 }4 j4 H' Q谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

jiabiaohu

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  N  R6 e3 S7 ]3 X; i3 ?* F
- M9 ]' v/ ]& x+ N7 A# Q' u测序单上一般有PCR引物测序的，一般有两个选项，PCR纯化产物（即你跑电泳后割胶得到的），另外还有一个PCR未纯化，这个你也可以直接送过去，当你注明之后，测序公司会给你纯化的，当然测序费用可能要高些~~~