关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。
# Z; [3 j" I* ~
3 I) g  I, @; T' N我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：  R) Y: |  ]: H
5 b! {  q! @; y4 k5 I
1. 全基因组DNA提取1 O+ Q+ o. f- K( W
2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端& d/ ?) }5 j2 F- h
3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接
5 T' u& t, b2 [. e6 z- V4. 1st-Round PCR
$ c- @  V, i- C0 V3 f5. 2nd-Round PCR8 L! w' d7 I9 h0 D
6. Sequencing
6 ^* C, V: i. k; K  ^
" y2 z. K6 _1 I- f6 C3 g5 K, u& ~/ R现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
1 [0 x3 m9 {- e( O9 u因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
% p8 {5 x$ Z$ D4 Q7 H3 l1 \* `# y5 O
比较着急，希望高人指点。谢谢~/ J- v% m1 W+ u* @, O! E0 _% m" b3 F
' y& u8 G$ z4 v9 {4 J4 N
附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

splinkerette

LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

splinkerette

附上文章

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子- ]' Z( J! B+ b  I. y* q

. D' F' O+ i" V2 F谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

splinkerette

呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

钻石星辰

5 O5 r& x; N1 N5 e3 m

# o2 s0 y3 o( h$ S8 C& B回复 splinkerette 的帖子, V% Y0 u* ]& o* f4 Q* h5 R

% D$ \- c2 j9 @7 G% l/ G$ v3 P你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。% n9 X  p1 s4 E9 l5 ?) v

$ T8 n& u# Y% u$ c- u3 N不过，我还有两个小问题：
, f2 i% L& e( R& w* T
4 ^+ K. ^5 C8 `8 H: R; `* ]1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。
# u9 l8 E; |9 q, q3 m' ?% U" `这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？
6 e" E4 a* n' X- B6 @, m
* x: u6 P) E: _+ u（没有用过NEB的酶不好意思）
* T  j! \! |0 u
+ P$ ]2 q( [) ]* q  G2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？0 M% Q3 g7 [. _0 u# G

% ]: `# g, D3 l, O% Y. U+ m; Z

splinkerette

回复 钻石星辰 的帖子' h& X: ^! a( @/ g

3 z9 `+ |/ |/ k6 k% O你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。& [( Z3 Y( Y; J- b! ?' o5 i
5 u% g. V8 A, ?1 ]
两个问题：' E! p4 K5 ]7 m$ \! e
1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，" b& g2 X6 v/ _/ ?; g
至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。+ g7 n; t' R; i3 n$ m
6 q9 H2 H! b- s+ a0 z
2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶  t' S9 K* @8 W+ M
附上一个图吧：( i( \5 i7 w* d  L6 J3 f6 G- R3 Z

splinkerette

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& ~4 W& m9 p2 Z, pP.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子+ H9 h( J# n* r) O1 ?9 H

; h/ X* u8 d) y) W谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

jiabiaohu

回复 splinkerette 的帖子9 c+ F8 P& v, J( |5 E
+ T& P+ f0 c& ]( I& q% ~+ m3 p7 y/ n( W
测序单上一般有PCR引物测序的，一般有两个选项，PCR纯化产物（即你跑电泳后割胶得到的），另外还有一个PCR未纯化，这个你也可以直接送过去，当你注明之后，测序公司会给你纯化的，当然测序费用可能要高些~~~