WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

回复 shuixiao 的帖子$ l2 w6 I1 e& u/ N6 _: z1 [
2 X6 |+ C* T8 D  a; ]0 z
用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子. m. N) d$ x* T6 k. ?, r6 l: I
' {; m2 ]! ]: z; v8 X: c
谢谢，自己做的

zhenhua

) Z0 k; L5 p6 a8 V7 w
; N( W0 j/ j3 f/ [呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
5 s* K+ W' H$ E/ R( t# g5 N- o6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
' j* f: f. ^1 j  {) z, N1 Y如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。4 I/ ~. x4 F2 D. w. c
还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。5 {+ W, ~& h* |: [3 d8 H! l
这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
& i3 r6 T/ S$ x" B( q最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

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4 M" k) u( `9 `3 T
5 Y$ U/ j4 V& @) k# M' O每个孔上20ul。- d$ R7 p6 z" G; I) a
煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

& O; R% A  \6 F
: z# X8 v' F! j. p' m0 K
我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

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