WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

回复 shuixiao 的帖子; n' ~! f1 m, X+ b, j/ |

( x* u7 _7 j. ]( y, t5 f用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子6 j1 B/ C: m7 R7 ]' T- ?, X
) h2 m9 e0 ?' C" f: E7 t+ E, B) ^
谢谢，自己做的

zhenhua

0 u" d* p1 k: ~3 X% [0 e
2 i9 G: t( w+ y8 J6 A. a
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
6 @  A1 T% e$ m& I0 S0 u) ~6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？/ b5 a- N0 {; a( R6 T2 Y/ [
如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。
& f  t% A* J* ~2 H8 a还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。
, s$ H: p; `4 o- D3 B" p这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
3 p* x4 ^/ I2 Z4 T* ], m最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

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$ N/ u7 m: C/ Y5 x5 L6 `
+ G$ A& {# I7 B# r3 l8 L: j0 q4 q每个孔上20ul。
. {0 N% h, o$ _% q( i煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

9 ~" b1 N5 [) J7 q  Q9 G& V( Y: G/ e6 R9 d: T; G
我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

回复 hndxws 的帖子+ j9 p+ |# {9 A' Z( I; q

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