请教高手：怎么才能做出好的ＥＢ呢？

wawj

我是做ｍｉｐｓ，做了几次ＥＢ，都形成不好，不是圆圆的，要么很散，要么奇形怪状，还有“三胞胎”，“双胞胎”。我是用悬滴法做的。求教怎么样的细胞状态才算可以做ＥＢ进行下一步诱导分化呢？怎么才能形成好的ＥＢ？

wwy551

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8 X& l2 \4 K- s) Z/ c) s3 I& z! D4 m4 M/ m/ R
我以前做过EB分化造血细胞，不过是hESC做的。因为当时做的EB状态都很不错，所以说说给你参考一下吧~~  Q; C- w, D5 z# F8 q; ~6 s
dispase消化ES比正常传代消化的时间久一点，等ES克隆自己脱落之后，收集至离心管中，不离心，静置离心管让里面是克隆自然沉降，然后吸去上面没沉降下去的MEF feeder。DF12洗一次沉降的克隆，依然让克隆自然沉降，吸去上层的DF12。这样做可以保证得到的都是状态很好的克隆。最后用ES的培养液重悬接种至低贴附培养板。第二天开始用分化培养液分化。一般刚开始的两天，EB在显微镜下看起来发黑，随后就会慢慢变得圆溜溜，亮晶晶~~

wawj

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" j' @9 M# Q8 u( C谢谢啊。可能小鼠的跟人的还是有点不一样。我跟您方法不太一样，我是离心后重悬接种到瓶子里差速贴壁两次，先20-25min,再5-10min,都是为了去掉feeder,得到相对纯的ips.您使用悬浮形成EB，我是用悬滴，听师兄说悬滴形成的大小均一，相对好一点。可我这几次做的都不行，可能还是细胞状态不够好吧。有点郁闷啊

wwy551

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- W. t! _5 h) _  Q
6 N* i  w& V! c2 m5 e当然了，做EB对ES或者iPS的要求也挺高的，ES或者iPS状态要好做出来的EB才会好。
5 \# p% K2 c6 Z3 b另外，我用静置沉淀ES克隆的方法去MEF的效果很好啊~~

wawj

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! t3 {/ g2 {% k# m3 J8 j. o/ J( X
对，是不错。自然沉降，mef feeder不沉降吗，没这样做过，不知道。还是要沉降多长时间？

wwy551

回复 wawj 的帖子" G( u7 v# b7 h% q8 h

# Q, j' W4 C4 A& n0 e% b" IMEF当然也沉降，不过远没有ES克隆沉降的快啊，等到大部分克隆都沉下去了，吸去上面没来得及沉下去的MEF，而且这之后还会用DF12洗一次，这样也能保证很大程度去MEF。
4 P( `) g. c+ T7 D沉降这个不需要很在意要多长时间，看着大部分克隆都沉降了就可以了。我以前做的时候就直接把消化下来的克隆和MEF一起收集进离心管，就那么放着，然后做别的实验~~

刘森泉

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3 j6 R- d3 r! P  J" ]4 r& P如果向造血分化的话，把ES接至低粘附性培养板上，第二天按步分化就可以了吗？需要在EB完全形成后转移至扩增培养基吗？低粘附性培养板要用Gelatin或Matrigel包被吗？谢谢！

wwy551

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6 H! i. K8 H4 a: @; m# m' I1 Z. r# l' z$ J8 F; A+ w
把ES克隆用HESM重悬后接种至低贴附板上，第二天就可以开始用分化培养液分化。
: d, K3 s( F- P并不需要等到EB完全形成，在分化的过程中，EB会慢慢成形的。, H4 e/ P# t, c# x7 d1 F$ D2 a
所谓低贴附板，就是防止细胞贴壁生长的，不同于常规用的细胞培养板，比如做造血分化分选出来的CD34+造血前体细胞就可以放在低贴附板上继续培养，这样可以抑制内皮等其他需要贴壁生长的细胞的生长，也就间接促进造血细胞发生。低贴附板有商品化的，买来直接用就好，不需要其他胞外基质处理。1 b& \) X- w5 |9 w2 ~4 `4 L  L
另外，实验室用的普通培养板如果经polyhamin处理的话，也可以当低贴附板用。

刘森泉

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' Z4 L7 d  h8 n2 m谢谢！请问dispase可以用collagenase IV代替吗？ES部分分化了同样操作可以去除已分化的细胞吗？

wwy551

回复 刘森泉 的帖子( @& T& c. S7 l' G
  G" V5 r9 T) R
用collagenase代替dispase应该也可以的，我们实验室只是很普遍用dispase。
0 \6 P$ `+ P$ Y. |/ u如果有分化的ES，看分化的严重程度了，如果很严重的话，建议还是刮掉，毕竟ES状态不够好，做出来的EB状态也难好。如果只是少量边缘分化的话，应该影响不大，经过之前降到的那种自然沉降处理，还是能够把中间的克隆跟边缘的分化细胞分开的。