脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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7 n4 I& t* `9 R* h, u将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
; O* p* n# `) T; \& x% @剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。1 d# \& ~' k! l5 J& R
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；' E' M; j1 j6 q/ O- x) j8 g* W
5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。  N: w9 b! k6 F- @- G) h' Q( Y
以上是我的组织块贴壁法，请教：5 f7 \; W# _: N9 l5 I; t+ {
①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？3 @& h" P& s3 `  @+ e/ p
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?4 n. |! E$ R2 T
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。
0 M- U4 v8 t8 y. d# M; p6 F9 t$ y剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？  }! D- X, K9 ^* n/ @
用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
( z& Y( U. K! d0 o. d9 }6 {以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

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回复 老姜 的帖子' w; S- {1 e8 f; {. A
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: x( V+ |3 v$ P. ?! e, M2 X2 i: n这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
9 ^$ Q% a. }/ l- e  l. y需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。1 N6 p( q& I3 z2 m& f5 @
离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。# w. @" e. R4 z4 j
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 & U* T. @, v! F$ P# a- K8 R
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3 E/ f% a" S# E0 u  J! P! N, }& C你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿. F8 f$ _+ F/ b2 R
先剪成条儿，再剪成小块儿8 k! y0 O& j: a) z, E% U
要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起( `7 g( Y$ a, V4 {
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

回复 湖南干细胞 的帖子3 G8 S+ w1 ~) S( m8 E
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1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。
+ _. S+ n: H* f5 @2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。7 _$ f! V8 d/ r9 Z; K9 _
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）
9 e4 F4 l$ d8 Z; R  G% ]: B$ A) ]% z4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
* l  A3 f8 U$ F# t供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子$ a1 n; Y4 K# O( R/ @7 g

% m8 S4 p9 K7 A! H! X需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

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回复 dongxin 的帖子
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谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！