如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议* i% {% @' v3 r
' L$ d; N. o: C# Y* x) K; d8 l
自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内
( G3 @. z8 F' [8 q4 d, p" X7 M
8 a* \* G% j. G, ^: h问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。, \/ [. _* |. _5 T( N& ?
4 x- M! K( W, x9 `8 y% P
拟解决方法：  ' s% h( j, {/ J, R
方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。
8 X1 `0 J- {% t4 z方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   
; N0 [$ ]' g- {6 @; e# [5 O9 @8 l               写着 发现有点牵强···）, F- g4 R) w( ~1 t- P+ m
方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···
7 |, a" Z9 S4 q# U$ C" y6 t$ Z
6 }# V7 `$ u! S4 L& S2 x7 [$ R
! O  o" R6 q- r9 ]2 t
恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

小兔子lp

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

daiying5200000

建议用荧光共振能量转移。

寒山拾得

IF & 提核蛋白WB

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；: M) `$ C/ @  }% x' Z& Z
2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；6 x4 {' u$ [# C. t8 k* s* r
3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；
2 x  c# O7 w/ D4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；
) H- E0 r# }6 s* M! f( {; H5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
& V! g% V% g) m% n4 |0 C7 q6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。6 I2 u, L9 r3 Z6 c+ \
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。
7 r, e! W; ^8 G. U5 b# v
$ k1 v; I5 S' o（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）
5 @& j/ S: ?2 o; z

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子
' y  T$ |& R: z' j: e3 N$ A" y1 M, B; M9 E$ n( O% G) W: n
首先谢谢你们的意见和建议；. r7 U9 g! y( X
- T6 [: i& Q! ^6 C+ b
自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；2 K: ]/ _5 Y7 X) l; a) T
构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。
- s8 z( W3 M, E& d2 d' d/ s  K( i" E蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；# o7 x% H# z0 W4 F# g7 K( C
$ o/ w9 |8 U# W" M6 D8 F; T
还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！
' I- i5 ?6 K$ r! [5 N0 Y对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  
. B# h, v1 d+ ]# p0 v6 _/ @( F
各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

) ^4 J3 e9 c  f+ Q  l7 b, h
6 _% P& a. c2 D) I9 S  u
回复 小兔子lp 的帖子4 F' V; f4 M3 b
/ K9 m0 n2 u+ e+ m( X- `& h
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

回复 寒山拾得 的帖子  h) {7 C' w  y" x( D6 p9 O

$ F; M0 s5 u* k7 x. W6 Q问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。( ?4 h2 A! H; u- x- G2 f. x; p1 y

* x# p  h# H5 P- |因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？+ g/ |0 l3 ], Q/ m, c

. ?4 A/ _& \! a如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
* X5 R/ r! t6 E8 Y( c7 J  a& u9 ]4 |( W: J$ w+ H
一个完全陌生的专业词汇···