如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议
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自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内
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% C$ @. x$ i# \, W* s' r" V! c问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。6 u6 z# q6 C' o9 m
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拟解决方法：  
  @- Q  V2 m/ G. ?7 e( b方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。
- u( m+ ?" ~& B+ f4 w# e方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   
. U. M: h1 m5 h" W$ e# s( j               写着 发现有点牵强···）
/ J1 m$ g: k" k3 W9 I$ v  _( i0 t方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···- c, o0 _$ _( o. e

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" w! F. U6 X2 J: r/ X恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

小兔子lp

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

daiying5200000

建议用荧光共振能量转移。

寒山拾得

IF & 提核蛋白WB

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；
# W. Q& [, n' a+ x- H3 G2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；
* E& h# g8 r, T- o2 B, x/ a; w3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；
& ^: ]" x( K, G9 T) Q4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；
" [$ Q9 W; p% R# D5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
  C+ y  {$ l! q' s6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。) Z8 y' D, w% M. }: J# d
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。# n0 V5 Y4 d) n7 s4 B

' m" a1 w. g, E4 g（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）5 L4 w/ U" ^1 D8 c% O

Andyhigh

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首先谢谢你们的意见和建议；' S9 t& r& Y+ U8 ^& a
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自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；1 u4 w: N# \: S7 g1 W. g4 i
构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。
- E+ [. Z; N( C0 r蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；$ V4 l- H  O4 P7 P* k& N

/ }3 x% o* T4 ?" y( a还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！7 Y4 M+ W. ?4 a7 I
对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  
" D& L, p0 H7 J, h; I) ^' D; A! g7 l0 [. J6 y4 m7 m+ E
各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

: ^1 Z7 L- |: S, v: a, F) I# T' t
, d; A2 }9 ]& P
回复 小兔子lp 的帖子0 f% p  c5 G) [$ o" O8 r. P
" O3 Z& L7 \( J5 X  C4 u
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

回复 寒山拾得 的帖子1 c2 b/ w: ~2 k& m- r/ Q7 w" b

; q( }  O( h# R* \问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。# M: x& A$ s3 ~2 u
# O4 w( H4 h) ^4 B5 [
因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？
& @2 m$ u( s( Q& Y+ Z/ d4 Q8 I9 f- G4 U+ W. r
如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
/ y' P# U$ O. v3 H" A- l& U  ]1 x9 r; R. x. V
一个完全陌生的专业词汇···