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关于间充质干细胞培养的一点经验    

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优秀会员 金话筒

发表于 2011-7-18 13:32 |显示全部帖子
本人从年初开始接触MSC到现在或多或少积累了一点经验与大家分享。我一直采用的是DMEM-HG培养基,加进口血清。开始的时候用10%的FBS,细胞长势不算太好,用过20%的FBS成本高是一,还有人认为容易导致细胞老化。经过摸索现在用12%FBS细胞长的还挺好。在P0和P1,P2,P3阶段的培养我一般加4ng/ml的bFGF.;以后就不用了。我的细胞一般传到P7-P8就会老化,但是也看供体的年龄,有一些样品好的可以传到P11。但是太老了也不敢用来做诱导实验怕影响分化。细胞在传代过程中一定要离心去除胰酶。可能有的人一直这样做。但是我以前养别的细胞都不离心,胰酶消化后,加入含血清的培养基按一定比例传代加入新培养基即可。但是我发现MSC不喜欢胰酶的存在,哪怕一点点也有影响。还有一项是去除杂细胞的方法。P0长满后,用胰酶消化,虽然大部分细胞都挺好消化,往往有一些比较顽固的细胞形态比较像破骨细胞又大又圆比较耐胰酶。我第一次消化后用含血清培养基中和胰酶后转到离心管内。培养瓶用PBS再清洗一次,又加入1ml左右的胰酶放入37度孵育较长的时间不管细胞死活,只是将那些不易消化的杂细胞尽可能的消化下来。然后加入大量的PBS清洗,清洗下来的细胞就不要了,直接吸到废液缸里。将第一次消化下来的细胞离心,按一定比例传代(1:3,1:4,有时也用1:5)视细胞量的多少而定。; |" @" w7 ?; W) p9 k2 g
希望这些经验会对各位有所帮助!
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金话筒 优秀会员

发表于 2011-7-18 13:47 |显示全部帖子
楼主请问:关于MSC不喜欢胰酶的存在的说法你做过相关的观察吗?目前我们也是不离心去胰酶~证计划离心去掉它~请问差距很明显吗?在有就是你一般传代密度的细胞数是多少?
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发表于 2011-7-18 22:15 |显示全部帖子
希瑞干细胞
学习了,感谢LZ...

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发表于 2011-7-18 22:15 |显示全部帖子
干细胞之家微信公众号
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优秀会员 金话筒

发表于 2011-7-19 14:54 |显示全部帖子
回复 sdwzg119 的帖子# ~% a# d. F1 A8 ~

; C* g/ ~8 d% ~; |& _4 w1 f( D是我个人观察出来的,以前细胞传代后不去除胰酶传代后细胞长的一直不好。有一次我的P0传代后细胞就像病了一样很难扩增起来,加bFGF也不行,现在回想起来很可能是因为没有去胰酶。我也是偶然发现的。有一次种细胞还有一些剩余,就又打回到培养瓶中。我想细胞经过计数反复离心状态肯定不太好。但是第二天一看长势还挺喜人的。从那之后,我就每次传代都离心去除胰酶,细胞一直不错,明显比以前的传代长势好。而且也有报道说干细胞过度在胰酶中暴露会影响其活性和扩增。好多国外的实验室不用胰酶消化干细胞。对不起我从来不查细胞数传代时。如果急于用细胞希望其迅速增殖,我就一瓶细胞长满了(T75)分到3瓶中扩增。如果不急我会冻存一部分只留下1/5或者1/4在瓶内慢慢养。
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发表于 2011-7-19 20:41 |显示全部帖子
胰蛋白酶消化以后一定要用含血清的培养基终止,然后离心洗涤,去除,再用新鲜培养基重悬细胞。
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发表于 2011-7-19 20:41 |显示全部帖子
胰蛋白酶消化以后一定要用含血清的培养基终止,然后离心洗涤,去除,再用新鲜培养基重悬细胞。

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发表于 2011-7-19 23:43 |显示全部帖子
楼主有干细胞培养的protocol吗,急需一份啊,我也一直在养干细胞,可是一直出不来,老鼠都被我宰了N个了,实在是不想杀生了。谢谢了

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发表于 2011-7-20 08:53 |显示全部帖子
回复 Learner 的帖子% d, k3 [  S- K" B0 e% m

; ^2 K6 X5 g+ s3 U/ ^' \$ i1 G不明白楼主为什么要浪费胰酶消化第二次啊,反正第二次消化下来的细胞都是不要的。
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发表于 2011-7-20 08:53 |显示全部帖子
问题一:加bFGF的作用是什么?我们不加貌似也可以长的很好。问题二:清洗下来的“杂细胞”当废弃液吸掉了那还浪费胰酶消化干嘛啊?
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