WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

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6 B7 @1 f1 {7 `
, s4 i" P; ?9 a0 u. R用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子* P) {. M3 p4 V5 `" ^  ]1 p6 D5 ?6 U
) t' U. [: }! k2 f! Y
谢谢，自己做的

zhenhua

0 [/ S" K9 P) I8 D4 M6 {+ R: H( _1 ?3 ?- Y1 ]
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？* l, x; p! s( D# Q9 ?, E
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
  {: o. x! Y+ q2 A9 D) `  ~2 d9 |如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。: W4 G) e5 x/ M, v
还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。
" I8 ^/ \$ \8 g5 T" D; U  X( E2 l% ]这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
6 l9 F+ _7 O6 [  a: a- p$ G4 C最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

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, N- W2 v+ r$ m* A3 p3 ?/ M; P" a/ M; f( W% B" v
每个孔上20ul。
6 p% |' q! [1 k3 A0 A' X" v煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

7 M8 W& H2 {0 `2 _  R

. `& |% M1 O3 @我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

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