WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

回复 shuixiao 的帖子* O) c2 q# P4 G/ A5 j: s

9 n6 `' P' s$ g2 |* Z2 H用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

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" k) O$ ]6 ~4 C% z* e5 A* R. S
8 A0 S) t( }) ^5 s- K+ F4 i谢谢，自己做的

zhenhua

4 [% e. k, t! G7 U) L( S6 g0 x+ N
3 \$ o8 A  p1 j7 L8 L
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
# E' ~9 W/ r( Z% G6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
) s) o# a1 n* q% j) R如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。
/ z% P1 S4 e& j& g+ B2 z还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。
/ i( E: Z& P  F1 e$ v这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。; ?# R% Q2 }- ^9 W
最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

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2 u* `2 Z. w: K" F; c8 @/ j+ `+ E* p7 G9 t  g
每个孔上20ul。
5 g, ~* {! m) z( @煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

: K# S2 T% m: a: z4 Y4 Y+ G9 d" d( W. ?
我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

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