WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

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3 ]2 X$ {  @& ?2 @0 H- p( E; p4 k8 f/ ~$ g
用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子5 F" g' j7 b2 a

+ K- N6 K8 Y- |# u5 ~+ D谢谢，自己做的

zhenhua

# S* O1 |, p" j$ O! {  u" m
7 X9 u- `; s- w9 [: |7 x/ x& o呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
6 u. ]( H9 J; P, ?* p. d+ M# j6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
0 W/ n$ S1 ^7 S" |8 Q如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。, O! E( e4 ~. `+ @$ J
还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。+ Q0 c# t6 `' C- d6 z& c+ c& f
这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。5 N& L4 w  m3 N" j( Q
最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

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; v7 }- M' W  u" P! A
& a! K9 q4 a0 [6 x; a) g每个孔上20ul。
, R+ _! v3 W1 x: P4 x' I. Y# k煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

) g6 @1 {3 J* S* d- D
9 k0 ~2 j: F" h: N; l7 x% O3 n2 S
我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

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