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. E3 O0 Y) ^" p- p' f我的操作步骤：& p# Z7 k. A8 X6 ]! H6 L; N
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】4 q4 ^% N" H" e& f7 A$ U: k
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；
* N; I' i" i. ~3 i. O0 F3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；5 q( e8 E7 d( g- x- d
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；: p/ U7 X$ K8 c. M0 X# A
5.“NEST” T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
7 a$ H# f6 Y- Q, `6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；9 H* a. v& v( v! F4 z$ c- ^
7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；. o- x Q) v+ D+ x D+ P
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；$ o+ e" Y `: h5 C
9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。. L0 ^) B4 C0 L7 K' U3 E8 z
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco; PBS---Solarbio粉末自己配的。
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我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
2 x/ L7 q; ]& `; `- X) H' G" ?附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍* |$ k7 W! K1 q5 Y, N7 ~# l$ Q( |- {
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发表于 2014-7-21 14:58
