培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

5 r9 a9 X( B9 ~9 m  U我的操作步骤：
9 T0 p" [& H+ S+ ?1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】3 T6 l0 k2 ?2 ]' b% T2 o
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；1 D1 i7 B( h5 c- o! P" _
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；7 |. |3 g6 \% B8 U  b" ]0 o6 o
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；+ J. K0 C( I" h3 c6 k  b3 j2 E
5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
' Q+ B' E$ t; v4 K  ?: p; b. I6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；) m$ d' Z& ~' R5 f
7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；
# W; ^1 `4 h4 k5 f) `$ m( g8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
' u0 F3 \$ A4 V0 G- X9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。
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我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
, R" c9 l+ ?( v* }- H附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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1 N! o6 J% K0 N) U

jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。
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# D! N6 w: y8 {: k. [' R$ v, p, P$ J另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

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" x6 h) M. ~+ }. l# u0 H
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9 F1 t  B; z+ C6 y( f请参照这篇文章的方法试一下：+ S; f+ W( n9 U& G2 I- t& E

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另，推荐阅读：; b" q/ m0 E' [9 C+ o
! g+ R: {: m/ ^$ N% y3 g) {% H2 g

• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：! f* ?0 o% f) b$ i0 D: Y
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• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?, C9 l* Z6 j' T$ i1 b# R$ E
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月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子# }" p# C9 F1 \4 r

9 V5 X/ I/ t% y+ `  q- g& R啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

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4 _6 k$ D, g9 h1 Q2 H好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

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% v* ~. h. {! G9 [/ ?( T/ V好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子( o% S) ^# Z1 v6 H

6 P) e9 o! |' o8 y  g: `我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？