求助ips复苏的问题

冬天的雪糕

我们现在用的小鼠mef饲养层，复苏is细胞，但是两周了细胞都没有长起来，只有一两个克隆，而且克隆一直没有生长。" [. J& r1 ^! O" J  z" @' G
有没有大神试过用饲养层复苏，而不是无饲养层培养液？有什么注意事项或者建议吗？3 t5 [# c; _- T0 a7 Y3 u' k6 b
非常着急！！

nichifanlema2

回复 冬天的雪糕 的帖子9 [  e; _: [; s/ m

2 D7 a5 q2 L2 L2 i- ]1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。% H5 P0 m- ~+ h" M$ Y. K) `5 F
2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作，不要吹打过于剧烈。5 y1 N. U; z6 l
3. 复苏后为提高效率，可以加入Y27632。
! ~* a1 c" U; j% x9 h0 U# v& ]. r4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。
3 M- T. w; _" G5. 克隆生长缓慢或者不生长，可能是饲养层太密了，也可能是培养基已经不支持生长了，可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。

watchen198891

楼主可以简单说一下你复苏的方式不？同意楼上的说法，还有其它的方面的问题，细胞冻存的方式，复苏的方式，冻存液的配置，复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式，太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题，MEF数量以及状态等。

冬天的雪糕

回复 nichifanlema2 的帖子
  X9 b$ _3 m* E+ |6 y+ W, G
- `8 d% g: X$ R$ \; K冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加，下次准备加了试试看。饲养层密度还可以，是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了，请问稀释冻存液加3ml每管可以吗？离心转数和时间请问应该是多少比较好呢？万分感谢

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子
  T) @1 v4 U9 z6 u' |
; @4 u; A: f1 ^( Gmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子; f! \, Z4 D7 o  ]1 d1 u

1 Y+ Z; d3 Y5 |, U6 I3 `& N2 i3 Xmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子
& w/ l% }# s( E$ H! L8 ]$ \# X  [! l5 l
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子9 o- d2 B& A% n  K% P

8 c$ Q1 e( _# m0 w1 Imef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子* r; e1 ]$ ^8 y, R
5 e1 ?1 v; `) j- f" p' I9 s8 I
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

nichifanlema2

回复 冬天的雪糕 的帖子: l+ Z) y; K0 c* {6 c" P8 N2 j1 [
6 N( W" M# F7 R* P
细胞吹打过度会加重细胞死亡，稀释冻存液时要缓慢滴加，一般4-10倍体积稀释没有问题，但是5倍以上稀释可能没有太大的必要，因为一方面浪费培养基，另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min，或者200g离心5min。