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求助ips复苏的问题 [复制链接]

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楼主
发表于 2015-7-10 20:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我们现在用的小鼠mef饲养层,复苏is细胞,但是两周了细胞都没有长起来,只有一两个克隆,而且克隆一直没有生长。4 E( u& S- K$ W5 U
有没有大神试过用饲养层复苏,而不是无饲养层培养液?有什么注意事项或者建议吗?
0 |& m$ U+ Y5 U4 @$ D  `, u3 U非常着急!!
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沙发
发表于 2015-7-11 10:42 |只看该作者
回复 冬天的雪糕 的帖子
9 h# {3 x7 |+ e! @1 l& p- w+ a! i' q; h7 E: K  T. `
1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。
5 U* S4 ~) Y; j  Z1 v. X2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作,不要吹打过于剧烈。! ]4 S, x/ e4 N. I1 f! U
3. 复苏后为提高效率,可以加入Y27632。) f4 q3 Y2 K+ f5 E+ B. B7 a9 ~
4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。
" e) _" A6 V! B  |0 k8 O$ w* k* ]5. 克隆生长缓慢或者不生长,可能是饲养层太密了,也可能是培养基已经不支持生长了,可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。
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金话筒 优秀会员 帅哥研究员

藤椅
发表于 2015-7-11 10:52 |只看该作者
楼主可以简单说一下你复苏的方式不?同意楼上的说法,还有其它的方面的问题,细胞冻存的方式,复苏的方式,冻存液的配置,复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式,太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题,MEF数量以及状态等。
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板凳
发表于 2015-7-12 16:53 |只看该作者
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回复 nichifanlema2 的帖子2 f' B# ?( X, v3 }  Y0 j7 X$ ]# O/ A

/ B, Q9 J3 D+ h- T- ~& e冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加,下次准备加了试试看。饲养层密度还可以,是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了,请问稀释冻存液加3ml每管可以吗?离心转数和时间请问应该是多少比较好呢?万分感谢
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报纸
发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子2 ?( g1 \% Y- H( A4 c/ `) F

6 e: {( p" V/ m+ w, Amef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?
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地板
发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子! J( @* N! W& e4 }. O9 a! n. x
' P3 J9 c8 {3 ~
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
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# y2 d# C" f' E  L& n" N3 Q
' N5 i( W5 n: W# G* p1 Dmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子
1 Q  Q2 l& j' ~$ V' a$ P4 a9 _
/ T# k0 a3 Q' }( X* Lmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子$ S4 j; H/ l, h" u4 @- w+ G( f

: q: M: V' Z, k6 d# O3 Smef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-13 12:17 |只看该作者
回复 冬天的雪糕 的帖子3 e3 w( h0 _4 C7 t7 T$ y% e9 q

+ E$ r0 S$ B; h" ]: |细胞吹打过度会加重细胞死亡,稀释冻存液时要缓慢滴加,一般4-10倍体积稀释没有问题,但是5倍以上稀释可能没有太大的必要,因为一方面浪费培养基,另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min,或者200g离心5min。
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