求助ips复苏的问题

冬天的雪糕

我们现在用的小鼠mef饲养层，复苏is细胞，但是两周了细胞都没有长起来，只有一两个克隆，而且克隆一直没有生长。
' C, u% I' N( ?5 e! {有没有大神试过用饲养层复苏，而不是无饲养层培养液？有什么注意事项或者建议吗？
! Z1 _, B$ \4 ]9 V# k1 s非常着急！！

nichifanlema2

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1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。
% @6 L: Z- a% e: q2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作，不要吹打过于剧烈。; T% F' v$ i5 q( E& H
3. 复苏后为提高效率，可以加入Y27632。
8 I+ j# q  q% O! W% r7 N4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。: F9 E8 E2 Y' I5 z. s2 W
5. 克隆生长缓慢或者不生长，可能是饲养层太密了，也可能是培养基已经不支持生长了，可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。

watchen198891

楼主可以简单说一下你复苏的方式不？同意楼上的说法，还有其它的方面的问题，细胞冻存的方式，复苏的方式，冻存液的配置，复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式，太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题，MEF数量以及状态等。

冬天的雪糕

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$ r" }8 S/ t9 ?, \7 F* W( k
冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加，下次准备加了试试看。饲养层密度还可以，是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了，请问稀释冻存液加3ml每管可以吗？离心转数和时间请问应该是多少比较好呢？万分感谢

冬天的雪糕

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

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nichifanlema2

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细胞吹打过度会加重细胞死亡，稀释冻存液时要缓慢滴加，一般4-10倍体积稀释没有问题，但是5倍以上稀释可能没有太大的必要，因为一方面浪费培养基，另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min，或者200g离心5min。