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求助ips复苏的问题 [复制链接]

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楼主
发表于 2015-7-10 20:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我们现在用的小鼠mef饲养层,复苏is细胞,但是两周了细胞都没有长起来,只有一两个克隆,而且克隆一直没有生长。
" Z; Z7 |- T! O5 _' s3 k有没有大神试过用饲养层复苏,而不是无饲养层培养液?有什么注意事项或者建议吗?
' d8 b9 o2 V8 x& M, ^* Q0 k非常着急!!
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沙发
发表于 2015-7-11 10:42 |只看该作者
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$ I3 B5 m8 l" i9 N, b/ r) ]) r* _. e* l8 R
1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。* V4 h+ y, P# z  L" p4 w
2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作,不要吹打过于剧烈。
& g7 r, i; A, n# ]3. 复苏后为提高效率,可以加入Y27632。; L. |* h! f7 J. q* F& A( ?/ O
4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。
1 [% [) B/ g% R5 c2 o% a5. 克隆生长缓慢或者不生长,可能是饲养层太密了,也可能是培养基已经不支持生长了,可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。
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金话筒 优秀会员 帅哥研究员

藤椅
发表于 2015-7-11 10:52 |只看该作者
楼主可以简单说一下你复苏的方式不?同意楼上的说法,还有其它的方面的问题,细胞冻存的方式,复苏的方式,冻存液的配置,复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式,太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题,MEF数量以及状态等。
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板凳
发表于 2015-7-12 16:53 |只看该作者
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回复 nichifanlema2 的帖子
9 j4 q3 K! @# I: x( m4 @4 h# v8 l2 E& M& K+ u8 y+ ~4 O0 m
冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加,下次准备加了试试看。饲养层密度还可以,是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了,请问稀释冻存液加3ml每管可以吗?离心转数和时间请问应该是多少比较好呢?万分感谢
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报纸
发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
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- s! y# V  i, ?& s8 v. W
0 k" T2 Q# s3 V' w5 rmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?
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地板
发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
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( I* J" L7 M$ J- n7 f2 T) V7 z1 O; A. M( P
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子
: z% s: B. D- b! X7 {
2 P, \, f; t" W3 H. N/ H1 I! Wmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子! y- A$ o* V$ ?! }+ G
9 {, ^( H: ~+ n; k
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子/ E- Q6 C9 L* q9 P" d% ?

& u6 }( I& _* G# y+ gmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-13 12:17 |只看该作者
回复 冬天的雪糕 的帖子" ?: L/ q8 I4 P
0 c; q0 }: n! t/ ]
细胞吹打过度会加重细胞死亡,稀释冻存液时要缓慢滴加,一般4-10倍体积稀释没有问题,但是5倍以上稀释可能没有太大的必要,因为一方面浪费培养基,另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min,或者200g离心5min。
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