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求助ips复苏的问题 [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2015-7-10 20:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我们现在用的小鼠mef饲养层,复苏is细胞,但是两周了细胞都没有长起来,只有一两个克隆,而且克隆一直没有生长。
' C, u% I' N( ?5 e! {有没有大神试过用饲养层复苏,而不是无饲养层培养液?有什么注意事项或者建议吗?
! Z1 _, B$ \4 ]9 V# k1 s非常着急!!
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沙发
发表于 2015-7-11 10:42 |只看该作者
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% W& ]! n3 h' [8 n4 e  w* z) @. q! `* @; a4 @  t
1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。
% @6 L: Z- a% e: q2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作,不要吹打过于剧烈。; T% F' v$ i5 q( E& H
3. 复苏后为提高效率,可以加入Y27632。
8 I+ j# q  q% O! W% r7 N4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。: F9 E8 E2 Y' I5 z. s2 W
5. 克隆生长缓慢或者不生长,可能是饲养层太密了,也可能是培养基已经不支持生长了,可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。
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金话筒 优秀会员 帅哥研究员

藤椅
发表于 2015-7-11 10:52 |只看该作者
楼主可以简单说一下你复苏的方式不?同意楼上的说法,还有其它的方面的问题,细胞冻存的方式,复苏的方式,冻存液的配置,复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式,太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题,MEF数量以及状态等。
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板凳
发表于 2015-7-12 16:53 |只看该作者
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回复 nichifanlema2 的帖子: w/ [& h2 n$ g* z8 Y
$ r" }8 S/ t9 ?, \7 F* W( k
冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加,下次准备加了试试看。饲养层密度还可以,是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了,请问稀释冻存液加3ml每管可以吗?离心转数和时间请问应该是多少比较好呢?万分感谢
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报纸
发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
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! X' Q0 x3 T# ~4 }: P! Z" n" ]+ R( w2 Z! A  `
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?
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地板
发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
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( w" T$ {& C9 q3 M
- ^7 d! ^& c3 [% S3 x) Vmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
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% y6 v1 a# ^8 r) _3 Z  W
( e9 `) x7 Y! `; o3 G) Umef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子4 W8 h9 o- C/ t1 a" J8 @

( M1 B. j: S7 x4 o$ h4 r: bmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-12 17:00 |只看该作者
回复 watchen198891 的帖子/ W) w2 e7 |. F* A, j* c

  {) N, t) Z, i0 p9 dmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗?离心时间转数应该是多少呢?还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢?是不是加到培养基,直到克隆状态良好,在更换培养基?

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发表于 2015-7-13 12:17 |只看该作者
回复 冬天的雪糕 的帖子
' b7 U* D8 M9 |. S+ R. e$ ^3 T: u6 d% \6 |) P
细胞吹打过度会加重细胞死亡,稀释冻存液时要缓慢滴加,一般4-10倍体积稀释没有问题,但是5倍以上稀释可能没有太大的必要,因为一方面浪费培养基,另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min,或者200g离心5min。
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