WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

回复 shuixiao 的帖子2 w" U* _8 |( u- z! R9 Y
3 L% F2 o+ \) k7 d- c, h
用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

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- {3 K$ Q" q! X
+ h* h0 m# K& y( p8 `; I* Y谢谢，自己做的

zhenhua

/ g2 |' k5 }" l4 J1 @- o; {" K, W
, H1 N6 f5 ?/ ~0 H3 k6 ]呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？1 A; k- `0 v# @7 C2 x
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
- R% j' \0 k) ?4 f" A3 o- _% g如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。
  ]. C* x) @: Z& X8 N( F还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。
; S# O  E8 d7 V这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
. a7 M5 Y( K! a4 t! `* g最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

回复 zhenhua 的帖子& j2 k- E0 A% x: R9 E. m

; V- N' p4 _1 [$ v; |. K8 {0 Z# O每个孔上20ul。( A1 h) n' o0 R/ z/ c! ^8 T
煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

5 M- V: ^+ |9 {1 O0 {2 `
' ?: E7 t% x: Y* A9 Q我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

回复 hndxws 的帖子4 I- u5 ~* s- S& P. }: a' L9 r

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